１．はじめに
脊椎動物などの高等生物は外界からの有害物質に対して精巧な生体防御機構を備えている。細菌やウイルスなどの病原体が体内に侵入した場合、まずマクロファージなどの食細胞やＮＫ細胞が非特異的な認識により病原体を攻撃して最初の防衛にあたる。この防衛線が突破されると、Ｂ細胞やＴ細胞などのリンパ球が特異的に病原体を認識して攻撃を行い、さらに活性化したＢ細胞は分化して抗体を産生してこれを体中に放出する。
最初にマクロファージが貧食作用を行うとき、Ｔ細胞も重要な働きをしている。Ｔ細胞はマクロファージなどにより提示された細菌抗原によって刺激され、総称してサイトカインと呼ばれる様々な種類の蛋白質因子を放出する。そしてサイトカインは他の免疫系細胞に対して情報伝達を行い、それによって生体防御機構の制御を行っている。そのなかにはマクロファージの走化活性を示すもの、マクロファージの活性化をおこなうものなどがある。１９６６年にＤａｖｉｄおよびBloom & Bennett らによって見い出されたマクロファージ遊走阻止因子（ＭｌＦ）は最初に発見されたサイトカインである1,2)。マクロファージはＭｌＦなどのサイトカインの働きによって感染部位に集められるのと同時に活性化される。活性化したマクロファージは、細菌を貧食して破壊する。
このように、結核菌などの細胞内奇生性細菌に対する生体防御機構においては、さまざまなサイトカインが相互に関係しながら制御を行っている。最近の報告では、ＭｌＦはＴ細胞の他にマクロファージや脳下垂体からも必要に応じて分泌され、グルココルチコイドと拮抗して免疫抑制や炎症作用を制御していると言われている3,4)。しかし、ＭＩＦはわれわれの体内で重要な役割を担っていると考えられて長い間研究されてきたにもかかわらず、その生理的な機能を理解するのに有効な報告はなされておらず、依然として生体防御のプロセスは明らかにされないままである。そこで我々はこの蛋白質の機能を、原子レベルの立体構造に視点をおいて研究することが必要であると考え、Ｘ線構造解析を行った。
2. 結晶の調整
ラット由来のＭｌＦは分子量１２．３ｋＤａ、アミノ酸残基数１１４の蛋白質である。溶液中での実験からは２量体を形成していると考えられていたが結晶中では３量体であった。まず、大腸菌メチオニン要求株で蛋白質を発現させ、単量体中に３つあるメチオニン残基をすべてセレノメチオニンに置換した。セレノメチオニンを用いた解析法では、試行錯誤でのソーキングによって重原子置換体を作製する手間がなく、確実に位相決定可能な重原子置換体が得られることから非常に有力な手段として今では広く利用され始めている。しかし、ラットＭｌＦのＭＡＤ法による構造解析は、初めのうちはうまくいかなかった。最初にできた結晶はVｍ値から推定して非対称単位中に１あるいは２個の３量体分子が存在し、独立なセレンの数は１×３×３＝９個となる。その位置をパターソン関数から決定するのが困難であった。そのような理由から、解析の邪魔になりそうなメチオニン残基は遺伝子操作でアラニンに置換することにした。このとき、アミノ酸配列中の２、４７、１０１番目のあわせて３つあるメチオニンのうち、どれを残してどれを変えたら良いのかが問題となったが、２次構造予測や疎水性残基の位置関係などから、なるべく全体の立体構造に影響がなく、分子表面にあって温度因子が比較的高そうなメチオニン残基を予想した。そしてそれらをアラニンに置換した複数の種類のミュータントを作製した。結果的にはそれらのミュータントでより格子の小さい結晶系が得られ、その条件でネイティブの蛋白質を含めていずれも同型な結晶が得られた（Table 1）5)。
３．回折実験
回折強度の測定は高エネルギー物理学研究所Ｐｈｏｔｏｎ ＦａｃｔｏｒｙのＢＬ１８Ｂで行った。セレン原子のＫ吸収端は０．９８Å付近にある。蛍光Ｘ線を観測して吸収端の波長を確 認した。図１の矢印が示すように３波長でＭＡＤのデータを収集した。結晶はＣ軸方向に長細い形をしていたのでその方向に結晶を並進させることで、３つの異なる波長のデータを常温で１個の結晶で収集することが可能だった。このことで結晶による吸収の差などから起こる波長間での系統的な誤差がおさえられた。また、バイフィット対が１枚のＩＰフレームに測定されるようＣ軸を回転軸に一致させてワイゼンベルグ写真を撮った。セレンの数の異なる蛋白質の結晶が３種類あり（Ｔａｂｌｅ１）、全てに対して３波長で回折データ収集を行った。
４．構造解析
データ処理はＤＥＮＺＯ6)とＣＣＰ４7)を用いた。重原子位置の精密化と位相計算はＭＬＰＨＡＲＥを利用した。図２はモノマーに１個のセレン原子を含むミュータント結晶のパターソン関数を示す。この結晶は非対称単位中に一つのモノマーを含む。ハーカーセクションＷ＝０面にはこのように２０σ以上の明瞭なピークが現われた。それに対して図３にはミューテーションをかけないで３つのセレン原子を含む結晶のパターソン関数を示す。図２の結晶のセレンに相当するピークは明瞭であるが、それに比べて残りの２つのセレン原子のピークは不明瞭である。これはセレン原子の温度因子をそのまま反映している。図３のマップでも解釈は十分可能であり、そのデータからの位相情報の利用も可能ではあったが、この構造解析ではデータの質が一番良かったセレンを１個だけもつ結晶のデータのみを用いて行った。プログラムSOLOMONによる電子密度の改良後のマップは、最後までディスオーダーしていたＣ末端の１１残基の領域を除いて非常に良質なものであり、プログラム○を用いて簡単にモデルの構築を行うことができた。（図４）
５．立体構造 図５にラットＭｌＦのモノマーの構造をリボンモデルで示した。２つのβαβモチーフが疑似の２回軸で結ばれた形をしている。４本のβストランドは混合βシートを形成し、２本のαヘリックスは逆平行に配置している。さらにＭｌＦの４６〜５０残基の領域には他の４本のβストランドに直交してもう１本のβストランドが存在する。このストランドは隣のモノマーのβストランドとの間で水素結合をつくり，ユニークな３量体構造を形成している（図６）。３量体の中心部分は５本のβストランドからなる３つのβシートによる“β−プリズム”があり、その周りに６本のαヘリックスが取り囲んでいる。この３量体は直径が約５４Å，高さ約３８Åの円筒状をしており、３回軸にそって水分子が通過できるほどのchannelが存在する。
さらにわれわれは、ラットＭｌＦの座標をもちいて、ヒトＭｌＦの立体構造を分子置換法で決定した9)。ヒトＭｌＦの電子密度にはラットではディスオーダーしていて見えなかったＣ末端の１１残基がはっきりと現われた。そしてそれらの残基はさらに３量体中のもう一方のモノマーとβシートを形成していた。すなわち３量体の中央にある３つのβシートは３つのモノマー全ての寄与により、合計７本のβストランドで形成されている（図７）。
６．異性化酵素としての機能
このような構造は一見インターロイキン−８や主要組織適合複合体ＨＬＡ−Ａ２といった蛋白質に類似しているように思われるが、これらは単量体として存在しフォールディングトポロジーも全く異なっている。ＳＣＯＰやDEJAVUといったデータベースにもＭｌＦのようなモチーフを見つけることができなかった。しかしながら、われわれはごく最近に構造解析された大腸菌のもつ不飽和ケトンの異性化酵素5-carboxymethyl-2-hydroxymuconate isomerase(CHMI)に同じモチーフを認めることができた（図８）10)。さらに、この酵素とＭｌＦの１次構造を比較してみると、18%ほどの相同性が確認できた。ＭｌＦはこれまでに異性化酵素との関係は全く報告されていない。ＣＨＭＩもＭｌ Ｆと同様に３量体構造をとり、モノマ一間の相互作用の様式もほぼ同じである（図９）。モノマーに関して細かく見て見ると、ＣＨＭＩは１２６残基であるためループの長さやαヘリックスの方向などに少しちがいがあるものの、フォールディングトポロジーは極めて似ている。
したがって、３次構造の類似性から、ＭｌＦの異性化酵素としての活性が推測される。その後の研究では予想どうり、ある基質に対しての異性化活性が確認できた。ＣＨＭＩの活性部位はＮ末端付近の分子表面のポケットにあり、プロリンを触媒基としてアルギニンなどの負に帯電した側鎖が基質を安定化していると報告されている。Ｎ末端のプロリンはＭｌＦでも保存されており、また、芳香環側鎖に囲まれたポケットが存在しているため、ここでＣＨＭＩとは異なる機構で反応を触媒している可能性が高い（図１０）。ＭｌＦが異性化酵素と機能的あるいは進化的に関係があることはまちがいない。しかし、そのような活性が免疫抑制および炎症作用の調節というＭｌＦのもつ主要な機能とどのような関わりがあるのかという点は今後の研究の課題である。
７．おわりに
この解析は鈴木守博士（高エネ研）、中川敦史博士（北海道大学大学院理学研究科）、西平順博士（北海道大学医学部）との共同研究である。また、放射光の利用にあたっては坂部知平博士と渡辺信久博士の協力を得て行われた。
文献