BL6B(TARA坂部プロジェクト)の使用説明書です。このマニユアルの製作は三木研 玉田氏、坂部研池水氏、同じく酒井氏、広津研岡田氏、田中研富長氏、その他大勢のビームラインアシスタントにより行われました。今後もこのマニユアルがいろいろな方の手を経て完全なものに近づいていくと信しています。このマニュアルとは別に甲斐研の栗栖氏によるBL6A、BL18Bに関する完成度の高いマニュアルがあります。そちらもご覧ください。

マニユアルの目次

ビームライン使用に関する工トセトラ
ビームアライメント
波長の設定
測定条件の検討
ポラロイドカセットによる軸立て
回折データの収集
回折データのバックアップ
回折データの処理
クライオクーラーの利用
利用可能なその他の設備
結晶準備室l＆Il
低温室
生理準備室
化学準備室
化学洗浄室
電気ストック
真空ストック
参考文献ガイド?
終わりに

ビームライン使用に関するエトセトラ

• 実験前のビームのアライメントはユーザーが行う。初回は中丸氏がユーザに手ほど きをする。
• 波長変更はビームライン担当者またはアシスタントの了解を得てからユーザーが行 う。次のユーザーへの引継ぎ時には波長を1.00Åに戻す。

  注意) 1997年11月の時点では波長の変更はできない。

  ハッチ内の温度は5℃から25℃の間で設定可能である。スイッチはハッチの裏側 (BL7方向)にある。ユーザは自由に温度変更を行って良い。クライオ実験等で気 流が障害になる場合には冷房を止めても良い。ただし、ハッチ内の温度を変えると カメラ部の膨張(または収縮)の影響でビーム強度が変わることが報告されている。 そのため、ビームアライメントをもう一度する必要がある。引継ぎ時にはハッチ温 度をかならず15℃にする。

• クライオ装置を使用する場合にはあらかしめビームラインアシスタントまたは中丸 氏に連絡し、装置の情報を得ておく。(ハッチから出し入れして使っているのでへ ッドの真空が悪化し、温度が下がらないことがある。)
• 実験装置は大切に扱うこと。破損させた場合には速やかに担当者に報告すること。
• 実験終了時には次のユーザーと引継ぎをし、波長、ハッチ温度、装置の状態の引継 ぎを行う。特に朝9時の引継ぎには中丸氏も含めた3者で引継ぎを行う。
• 実験装置、イメージ処理ソフトの状況に関してはJPXTALを通してユーザに伝えられ るので加入することが望まれる。

  補足) JPXTALは日本蛋白結晶学関係の方を中心としたメーリングリストである。こ れはPFのユーザーのためだけのものではないが、リスト加入者の過半数がPFに関係 していると思われるので情報を流させてもらっている。

  補足の補足)JPXTALは北大田中氏を中心として発足した。現在は蛋白研楠木氏、と PF鈴木が世話人となり運営している。リストへの加入、脱退は自由に行える。投稿 されたメールは直接リスト加入者に送られる。listproc@pfweis.kek.jpにsubjectとし てhelpと書き、本文に何も書かずに送ると入会案内が送られてくる。

ビームアライメント

ハッチ内

カメラの下流側にある2つのマグネットを取り外す。
カメラの下流側にある1つ固定用のばねを緩める。
イオンチャンバーを試料用へリウムパス用レールに取り付ける。 0.2mmの2点コリメータを付ける。

PC

Beam alignmentメニユーで、シャッター(F3)を開けてピコアメータを見る。

針が0をさしている → 1 へ
針がふれている → 2 へ

1. 0.2冊の1点コリメータを付けて様子を見る。X線が出ていない場合、さらに大き なコリメータを付けてみる。0.5冊のコリメータでもピコアメータがふれなければ、 中丸氏を呼ぶ。X線が出るようであればカメラを調整し、徐々に小さいコリメータ にしていく
2. DlRECT(F7)を押し、B+C、HR0T、VR0T、2θの4つを調整しピコアメータの値を最 大にする。HR0T，26はバックラッシュを取るために必ず右矢印(もしくはテンキ ーの6)で最後はあわせる。
3. 0.2冊のコリメータにつけかえて一応ビコアメータの値を確認。(2点コリメータ であわせた場合のカメラのパラメータと0.2mm1点コリメータ＋0.2mmφピンホー ルであわせたパラメータが同じであるはずだが、実際は相当ずれている。原因は2 点コリメータの工作精度の問題と思われる。)
4. 0.2mmφのピンホールをセンタリングする。
5. Z(ω軸の並進)をちょっとづつ変えてピコアメータの値が最大を示す場所を探す。 Zの調整はω軸の後方(ビームライン7番方向)にある。
6. 顕微鏡のクロスをビンホールにあわせる。
7. カメラ固定用マグネットを元の位置につけ、固定用ばねをロックして終了。

波長の設定

測定条件の検村

ポラロイドでの結晶の軸立て

A.ポラロイドカメラ操作法

1. Load/Process切り替レバーをLoadにする。
2. EXP0SEレバーを押し下げる。
3. This side toward lensマークが同じ方向を向くように合わせてフィルムを入れ、 まるまで押しこむ。
4. フィルムの上部を止まるまで引き出す。
5. EXP0SEレバーを引き上げる。
6. カセットをセットし露光する。
7. EXP0SEレバーを押し下げる。
8. フィルム上部を止まるまで押し込む。このときカセットの上面とフィルムの上端が 同じ高さになる。
9. Load/Process切り替レバーをProcessにする。
10. フィルムをゆっくり引き出す。もし引っかかって抜けなかったら、Load/Process切 り替えレバーをLoadにしてカセット荷担に金属ノブを押しながらフィルムを引き出 す。
11. 現像時間(約30秒)が経ったら写真を取り出す。

    

C.撮影
1-2度くらいの振動写真を撮影し、結晶の方位を修正する。(カメラ長は 160mm)

D.軸立て終了
ポラロイドカセット収納場所のフタをしっかり閉める。
(ここもヘリウム置換される。)

回折データの収集

A.IPの消去

1. IP表面をソルミックスとキムワイプで拭く。
2. 消去器に入れ、10分ほど待つ。

1. IP設置部を固定している金具を外すc
2. IP設置部をゆっくり後ろに止まるまで引く。
3. 固定用金具で固定する。
4. ハンドルをまわしてIP設置部を90度回転させる。
5. IPをセットする。
6. 密着のため真空ラインをつなぐ。手順は、左のつまみを閉じ、右を開ける。
7. ハンドルを回して90度回転させ、もとにもどす。
8. 固定用の金其をはずし、IP設置部をゆっくり前に止まるまで戻す。
9. 固定用の金具を止める。

C.ヘリウム置換

ヘリウム供給はメインシャッターのスイッチがあるラックの真ん中 にある装置で制御する。つまみを3のところまでまわして2までもどすと数時間供 給される。供給が停止してもブザーなどは鳴らないので注意が必要。流1はデジタ ル表示の値*2リッター毎分である。(補足)97年11月には新しいタイプの制 御装置に置き換わっている予定である。

1. IPリーダーの主電源をON
2. SGI INDYの電源をON
3. ユーザー名｢ip｣でログインする。(パスワードはアシスタントまたは担当者ま で。)
4. Shellを開き自分用のディレクトリーを作る。(mkdir n∞ame)
5. ｢start｣を入力する。コントロールソフトウエアーが立ち上がる。
6. メニユーが現れる。ファイル名を入力する。 現在は｢file｣｢scan line(0to 4000)｣だけに気を付けていれぱ問題ありません。

   注意)フアイル名には拡張子なしで入カしないこと。
   注意)フアイル名の先頭に空白を入れないように気をつけること。

7. スライド式の蓋を静かに開ける。
8. IPの露光面を表側(WHITE face is UPSIDE!!)にして、BAS2000とつじつ まを合わせるのならば頭(IPナンバーがついている方)から挿入する。このとき、 くれぐれも粗雑に扱わないように気をつけること。

   注意) lPの1牧の値段は250,000円です。
   注意) 繰り返しますが、IPの露光面を天井に向けてリーダにセットすること。

9. 静かにスライド式の蓋を閉じる。(読み取りが終わればl Pシートは元の位置に戻 る。)
10. Measure menuからexecuteして、読み取りを開始します。ここからトラブルがなけ れば、およそ14分で終了します。読み取り中はreal timeで画面にイメージが表 示される。

    補足)リアルタイムディスプレイはデータすべてを表示しているわけない。
    注意)読み取り中(読み取りライン数が3999になるまで)はいかなる作業も INDY上で行ってはいけません。さもないと責弱なINDYはすぐにデータ転 送に失敗します。

11. 読み取りが終了したらIPを確実に装置から取り除くこと。
12. displayを選択して、読み収ったイメージファイルを拡大して見ることができます。 ほとんどの操作はマウスで実行できますので、いろいろ試してみてください。

    注意)読み取り中に何らかの，常、例えぼスカジーエラー、l Pが排出されない、 ，常な音かあった場合、速やかに中丸氏を呼んでください。

データの転送及びバックアップ

pfweis4ではクローンが1週間経過したファイルの消去を行っているが、ハードデ ィスクのスペースの状況により、その前に無断で消去する場合がある。

注意) 転送は絶対にbinaryモードで行ってください。
注意) PFから自分の研究室に大きなファイル(イメージ)をFTP転送しないこと。

回折データの処理

クライオストリームクーラーの利用法

A. 液体窒素の汲みだし

液体窒素の汲み場は実験ホール入り口から向かって左(BL6Bに向かう方)の側 室にある。入室にはIDカードが必要である。。取り扱いは現場に詳しい説明書が あるのでそれに従うこと。液体窒素のポット容量は、大きい方で約30リットル、 小さい方で約10リットルである。クライオクラーの液体窒素の消費1は0.6リ ットル毎時である。最初、ポットに液体窒素を人れるときは、デュワーに水分が入 ってないことを必ず確認すること。水分があるとデュワー内部に氷を形成し、管に つまりを生しさせる原因になる。汲み出しを行ったのに名前、汲み出した窒素量を ノートに書く。

注意) 必要以上のの液体窒素を汲み取らないこと。

B.コード類の接続

1. それぞれ色分けされ、さらにマーキングされている。それを確実に丁寧に接続する。
2. 機器の設置とコードの接続が終了した後、各電源をONにする。(ハッチ内にある コントローラとハッチの外においてある乾燥空気ユニット)
3. コントローラのPROCボタンを押して様々なフェーズ(プログラムユニット)を 入れる。
4. 最初のフ工一ズはRAMP(制御した速度で温度を変化させるモード)にし、EN TERキーを押してから最終温度、変化率(デフォルト120K/h)を人力した ら再ぴENTERキーを押して碓定する.
5. 以上の条件でOKならば、STARTボタンを押す。
6. 終丁するときは逆にRAMPモードで温度を徐々に上げていき、ほぼ室温に戻った ら電源を切ることができる。

   注意) 測定終了と同時に｢いきなり電源を切らない｣ようにすること。

7. あとかたづけ−その後しばらく使用しないならば、多少残っている窒素をホー ルの外に捨て(人に隠れて)、デュワーを逆さにして中を乾燥させる。

利用可能なその他の設備

研究棟１階結晶準備室�T&�U

[主な設備]

電子天秤、顕微鏡、pHメータ、卓上遠心機、冷蔵庫、冷凍庫、製氷器、結晶保存 用インキュベータ(3台)、自動結晶化装置。

1. 本準備室を利用する時は予め担当者と連絡をとり，スケジュールの調整を行なうこ と。
2. 広範囲の占有は避けること。また、利用中、利用後は常に清潔にするように心掛け、 次の利用者が使える状態にしておくこと。
3. 結晶は大変にデリケートなものであるので他の利用者との間で協力して利用するこ と。
4. 当室には実験排水を処理する設備がないので有害物質の使用は出来ない。その様な 操作は化学試料準備室で行なって下さい。
5. 当準備室で飲食をしないこと。
6. 物品(薬品類を含む)を保管する場合には使用ビームライン、所属大学名、氏名、 保管予定期間を明記すること。特別の理由が無い限り長期保管はできない。ビーム タイム終了後に記名の無い物品は処分される場合がある。
7. 器具・装置などの破損、不調は担当者まで連絡すること。

研究棟１階低温室

[設備]

常時4±1℃、湿度601%に保たれている。

1. 当室は保温のため密閉されている。そのため、室内での作業中に酸欠になる危険性 がある。これを避けるために長時問の滞在は避けること。酸素メータで酸素濃度を 確認しながら作業を行い、ブザーがなったら速やかに待避すること。
2. 結露をさけるため、扉を速やかに閉しること。また前室の扉も開放しないこと。
3. 広範囲の占有は避けること。また、利用中、利用後は常に清潔にするように心掛け、 次の利用者が使える状態にしておくこと。
4. 物品(薬品類を含む)を保管する場合には使用ビームライン、所属大学名、氏名、 保管予定期間を明記すること。特別の理由が無い限り長期保管は許されない。ビー ムタイム終了後に記名の無い物品は処分される場合がある。
5. 当室には実験排水を処理する設備がないので有害物質を使用は出来ない。その様な 操作は化学試料準備室で行なうこと。
6. 当準備室で飲食をしないこと。
7. 飲食品の保存はしないこと。

研究棟１階生理試料準備室

[主な設備]

蒸留水製造装置、冷凍冷蔵庫(2台)、微量冷却遠心器、紫外可視分光光度計、顕 微鏡写真撮影装置、冷却高速遠心器、冷凍庫、電気泳動装置、振とう恒温槽。

1. 広範囲の占有は避けること。また、利用終了後の片付けを行ない、次の利用者が使 える状態にしておくこと。
2. 物品(薬品類を含む)を保管する場合には使用ビームライン、所属大学名、氏名、 保管予定期間を明記すること。特別の理由が無い限り長期保管は許されない。ビー ムタイム終了後に記名の無い物品は処分される場合がある。
3. 当室には実験排水を処理する設備がないので、有害物質を使う実験は出来ない。そ の様な操作は化学試料準備室で行なうこと。
4. 当準備室で飲食をしないこと。
5. 器具・装置などの破損、不調は担当者まで連絡すること。

PF内では廃液をともなう化学実験を行なうことができる唯一の部屋である。

[主な設備]

蒸留水製造装置、電子天秤、pHメータ、ドラフト。

1. 広範囲の占有は避けること。また、利用終了後の片付けを行ない、次の利用者が使 える状態にしておくこと。
2. 二次廃液まではポリタンクに分別回収する。
3. 当準備室で飲食をしないこと。
4. 器具・装置などの破損、不調は担当者まで連絡すること。

実験ホール内化学洗浄空

実験ホール内，電気ストックルーム

実験ホール内真空ストックルーム

参考文献ガイド？

WEIS

T. Higashi

J. Appl. Cryst. (1989). 22, 9-18.

DENZO

Z. Otwinnowski, W. Minor

Methods in Enzymology, edited by C. W. Carter Jr and R. M. Sweet P276 New York Academic Press(1996).

大型IP、リーダー

N. Sakabe, S. Ikemizu, K. Sakabe, T. Higashi, A. Nakagalwa, N. Watanabe, S. Adachi and K.Sasaki

Rev. Sci. Instrum. (1995). 66, 1276-1281.

大型IP、リーダー、BL6B

K. Sakabe，K. Sasaki，N. Watanabe, M. Suzuki, Z. G. Wang，J. Miyahara and N. Sakabe

"Large-Format Imaging Plate and Weissenberg Camera for Accurate Protein Crystallographic Data Collection Using Synchrotron Radiation." J. Synchrotoron Rad. (1997). 4, 136-146.

R0T法

N.Kamiya, K.Sasaki，N.Watanabe, N.Sakabe and K.Sakabe

J. Synchrotron Rad. (1997). 4，14-16.

終わりに

台風7号がせまりつつある筑波で　(文責：物構研　鈴木守)