結晶化・立体構造解析のためのタンパク質精製ストラテジー

構造生物　Vol.5 No.2
¶1999年9月発行

結晶化・立体構造解析のためのタンパク質精製ストラテジー

大島　典子
アマシヤムフアルマシアパイオテク株式会社

はじめに
- タンパク質精製を行うためのストラテジーは、まず精製工程全体の流れ(骨組み)を把握し、各段階を順を追って決定していきます。
- その流れを図1に示します。
- タンパク質精製を行う場合、同じカラム手法を何回繰り返しても同し性質のものを集めるだけでは分離しているとはいえません。また一回で高純度に単離精製されることもまれで、通常は分離モードの異なる手法を組み合わせて精製工程を決定します。
  精製過程はあくまでも試料を得る為の手段であるので作業は最小限に抑えます。
①分離精製の目的
- X線回折研究に必要な条件を満たす結晶を得るためには活性のある高純度なタンパク質を10mg以上調製することになります。
  また精製時に目的のタンパク質の特性により注意すべき点も最初に設定します。
  これらを考慮にいれて精製工程の検討・選択を行います。
②分離の要因となるタンパク質の性質
- 目的のタンパク質の性質から精製手法を検討・選択していきます。
- 目的のタンパク質の電気泳動を行うかあるいは構成するアミノ酸配列から計算上の分子量、等電点等を算出します。
- その他目的タンパク質の特性たとえば、280nmの分子吸光係数、塩安定性、疎水性、生物学的特異性(酵素一基質特異性)等も把握しておく必要があります。
Capture(回収)
- Captureのステップでは多量の粗抽出液からプロテアーゼなどの最も有害な不純物を迅速に除去し、目的のタンパク質を回収、濃縮して安定な状態に移します。
- ここでポイントとなるのは
  - ①結合容量
  - ②処理量
  - ③処理スピード
    です。
- イオン交換クロマトグラフィーは多種多様な交換体が販売されており、汎用性の高い手法です。イオン交換体の中でも吸着容量が大きく流速特性に優れた担体を用いて回収のステップを行うことが一般的です。
  このような高吸着容量担体のメリットは精製物の濃縮・処理時間の短縮・バッファー使用量の低減・更なるスケールアップの可能性・精製装置の小型化があげられます。
Purification(中間精製)
- Purificationのステップは様々な精製手法を組み合わせて目的物質の純度を高めてゆく工程です。
  ここでポイントとなるのは
  ・①分離特性
  ・②回収率
  ・③操作性
  です。
  作業は最小限に抑え、効率よく純度を高めていくためには分離のモードを変えることが効果的です。
  例えばCaptureのステップでイオン交換を用いた場合、目的タンパク質は塩溶出されます。
  そこでアフィニティークロマトグラフィーや疎水性クロマトグラフィーなどの高イオン強度で吸着する手法を選択すると分離モードを変えると同時にサンプルの前処理にも手間がかからず効率的に純度を上げていくことができます。
- 目的タンパク質を回収率よく純度を上げていく為に、クロマトグラフィー手法ごとに様々な条件検討を行います。
  その例を表・2に示します。
Polishing(最終精製)
- Polishingのステツプでは目的タンパク質の最終的な磨き上げを行うための工程です。微量に含まれる不純物の除去と純度確認を目的として高分離カラムを使用します。
  ここでポイントとなるのは
  ・分離特性
  です。
- ゲルろ過クロマトグラフィーは目的タンパク質をNativeな状態で分離でき、低分子物質の除去、多量体等の分離に有効です。またBuffer交換を兼ねることができるため結晶化の目的には大変効果的です。
  最近では分離能・再現性からみて非常に高性能で、なおかつ操作時間の点でも以前に比べ短縮できるようになったカラムが販売されています。目的タンパク質のサイズにより分画範囲の異なる担体を使い分けます。
まとめ
- このようにタンパク質の精製工程開発には様々なクロマトグラフィー手法の検討、効率的な精製手法の選択、最適分離条件の検討が必要になります。
  最近このようなタンパク質精製のストラテジーを迅速に実行していくための機能を兼ね備え高度に自動化したシステムが販売されています。
  この後、この最新のタンパク質精製システムを利用した精製工程開発の一例をご紹介いたします。

結晶化および3次元構造解析を目的とした酸素感受性酵素の精製

はじめに
- 非常に不安定なタンパク質を活性状態で単離することが、タンパク質化学分野においてひとつの壁となっています。X線回折研究に必要な条件を満たす結晶を得るためには活性のある高純度なタンパク質を調製する必要があり、この課題を克服することは、非常に価値あることです。
- 今回は酸素感受性酵素であるdeacetoxycephalosporin Csynthase(DAOCS)を例にとり、精製工程を開発しました。この酵素はStreptomycesにおいてCephalosporin/cephamycin生合成系の重要なステップで触媒活性を持っています。DAOCSは近年、精力的に研究されているノンヘム鉄依存性オキシゲナーゼ類に属します(参考文献:Roachet al, 1977)。
- Streptomyces clavuligerusのDAOCSをコードする遺伝子はクローン化されており、大腸菌を用いて可溶性タンパク質として大量に発現させることができます。
- 初期の実験結果から精製時間が短いほど結晶の品質が向上するということが明らかにされています。これは酵素の酸化修飾のレベルが低くなるためだと考えられました。
- 以上のことを考慮にいれるとこのタンパク質精製のKey Pointsは
  ①高純度精製:結晶化のための精製(Purify:99.9%)
  ②大量精製:10mg以上の高純度タンパク質を精製
  ③迅速な精製操作:全操作を少なくとも一日以内で完了
  があげられます。
- DAOCSの精製工程の全体の流れを示します。
- 精製工程はAKTAFPLC(アマシャムファルマシアバイオテクK.K.)を用い、システムコントロールを行うユニコーンソフトウェアのブログラム済みメソッドテンブレートとスカウティング機能(=条件検討の自動化機能)を用いて種々のクロマトグラフィー担体のスクリー二ングとグラジェントの指摘化を自動的に行い開発しました。
Goals
- 精製工程開発の目標を以下に示す3つに定めました。
- 結晶化およびX線回折による分析を行うために十分な純度のDAOCSを一回の精製で5-10mg得ること。
- 精製工程を一日以内に行うこと。
- 最低でも10倍スケールアップできる工程を開発すること。
DAOCS characterization
- 精製計画をたてるために重要なDAOCSの特性およびその精製への影響を表・3にまとめました。
Capture(回収工程)
- DAOCSの計算上の等電点(pl=4.8)から、中性pHでの陰イオン交換クロマトグラフィー(AlEX)が回収に適切であると考えられました。AlEXは迅速で濃縮効果があり、カラム添加前のサンプル処理も比較的容易で回収工程に適した優れた手法です。
- AKTAFPLCのプログラム済みメソッドテンプレートおよびカラム切り替えバルブ(オプション)を使用して、いくつかのAlEXカラム(1ml)のスクリー二ングを迅速に行いました。
  スクリー二ングおよび至適化実験において、ビークの純度、容量および目的タンパク貿の分解に関する評価はPhastSystem全自動電気泳動装置(アマシャムファルマシアバイオテクK.K.)を用いたSDS-PAGEによって行いました。
- これらの結果から、回収工程の開発に使用するカラムとして、担体QSepharoseXLを選択しました。この担体は添加容量が高く、化学的および物理的安定性も優れているので回収には理想的な担体です。このため、比較的小さなカラムで大容量のサンブルを処理することができ、苛酷な洗浄工程も行うことができます。
  また、スケールアップも容易に行うことができます。
- グラジェントの至適化にはプレパックHiPrep16/10Q XLカラム(20ml)を用いました。
  カラム操作は推奨流速の最大値(10ml/min)で行いビーク容量を最小に抑えるためにステップグラジェントによる溶出を行いました(図2)。図2右に示したワンステップのグラジェント溶出の場合に最も高純度な目的タンパク質が得られ、ピーク容量を最小に抑えることができました。バッファーにはプロテアーゼ阻害剤を添加し、SDS-PAGEによる解析で回収した目的タンパク質の分解は認められませんでした。
Purifcation(中間精製)
- 中間精製段階における焦点は、残存する不純物を効果的に除去するということです。ここでは結合容量および分離能がポイントになります。
- 中間精製のスカウティング実験はSDS-PAGEによって評価しました。
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー(HlC)は、イオン交換クロマトグラフィー後のステップとして論理的に適した手法です。ほとんどの場合サンプル調製として塩を加えるなどの最小限の操作で次のステップに移ることがてきます。
- ここでは、疎水性の異なるリガンドを持つ3種のRESOURCEカラム(アマシャムファルマシアバイオテクK.K.)を準備して評価を行いました。
- 疎水性の弱い順にエチル(ETH)<イソプロピル(ISO)<フェニル(PHE)となります。
  結果は図3のようになりました。SDS-PAGEによる分析により、効果的な中間精製のためにはRESOURCE ISO(SOURCE 15 ISO=イソブロピルリガンドを持つ)が最適であることがわかりました。
  実際の分取操作ではSOURCE 15 ISOで10倍のスケールアップを行い、グラジェントと流速の条件の至適化を行いました。(図4)
Polishing(最終精製)
- 残存する不純物の除去と純度確認の目的で行う最終精製にはゲルろ過を選択しました。ゲルろ過ではタンパク質は大きさによって分離されるので、前の2つの手法(荷電および疎水性による分離)とは異なるモードでの分離を行うことができます。DAOCSの分子量(34，500)分離範囲の適したカラムとしてHiLoad 16/60 Superdex 75 prepgrade(アマシャムファルマシアバイオテクK.K.)を使用しました。(図5)
まとめ
- 細胞破砕からゲルろ過によるDAOCSフラクション回収までに要した全体の精製時間は5.7時間で、このうちクロマトグラフィーによる分離時間が占める割合は50%以下でした。
- ゲルろ過で得られたDAOCSプールは10.8mgのタンパク質が含まれ、SDS-PAGE及び銀染色の結果、高純度に精製されていることがわかります。
  また、酵素活性を持つことも確認されました。
- 精製した酵素は結晶化のために直ちに濃縮しました。その結果得られた結晶(図7)はX線回折で1.3Å以上の分解能で回析データを得ることができました。(図8)

謝辞

この研究はMatthew Lloyd博士、Christopher Schofield博士(Oxford Centre for Molecular Sclences, United Kingdom)およびInger Andorsson教授(Department of Molocular Biology-Swedish University of Agricultural Scicnces, Uppsala)の協カによって行われました。また、EU grant BIO4-CT96-0126(DG12-SSMI) "Four-dimensional X-ray crystallography of penicillin and cephalosporin biosynthctic enzymes : Towards new antibiotics"にサポートされました。

References

1.Morgan，N. et al.(1994) Bioorg. Med. Chem. 4, 1595-1600.
2.Roach, P. L. et al.(1997) Structure of isopenicillin N synthase complexed with substrate and the mechanism of penicillin formation. Nature 387, 827-830.

クロマトグラフィー担体によるインクルージョンボディの再生

遺伝子組換え技術の進歩により、大腸菌細胞内での外来遺伝子の高発現が比較的手軽に行えるようになりました。しかし、その高発現のために外来遺伝子がインクルージョンボディ(細胞質内封入体)と呼ばれる直径0.2・1.5ミクロン程度の不溶性の凝集顆粒として生産されるケースがしばしば起こります。このインクルージョンボディは微生物の細胞内では最も密度の高い構造体であるため、内生の可溶性分子とも遠心分離などによって容易に分離できるものの、活性型の構造に戻すためのリフォールディングと呼ばれる再生操作が困難です。
リフォールディングの方法としては、高濃度の可溶化剤を希釈あるいは透析により低濃度化して活性型の構造へと導く方法が良く知られていますが多数のジスルフィド結合を有するタンパク質の場合など、再生が難しいケースも多く残されています。
このような問題を解決するための試みのひとつとして、クロマトグラフィー担体を用いた再生法について紹介します。

ゲルろ過カラムによる方法

塩酸グアニジン(GdmCl)や尿素のような可溶化剤存在下でのゲルろ過が可溶化したインクルージョンボディ中に含まれた不純物や部分的に形成された複合体画分を除くのに効果的であるとする報告がいくつかあります。
WeirとSparks(1)は大腸菌にて発現させたインターロイキン2のインクルージョンボディを10mMのDTTを含む8MGdmCl(pH8.5)で可溶化した後、可溶化液と同様の組成のバッファーで平衡化したSuperose 12 HR 10/30カラム(アマシャムファルマシアバイオテクK.K.)を用いゲルろ過を行いました。単量体インターロイキン2の画分のみを分取し、希釈によりリフォールディングを行っています。
同様な手法は、Gillらによる組換えウシ成長ホルモンの精製(2)、MarcianiらによるHlV工ンベローププロテインの精製(3)、Foutoulakisらによる可溶性ヒトインターフェロンγレセブターの精製(4)において報告があります。
さらに最近、ゲルろ過カラムで分画のみならずリフォールディングまでも行ったという報告がなされています。Wernerら(5)は、1分子中にシステインを9残基含む6-8M　GdmCl(pH8.5)にて可溶化したあと可溶化剤を含まないHEPESバッファー(pH6.8)にて平衡化したSuperdex75HR10/30カラム(アマシャムファルマシアバイオテクK.K.)で展開しています。その結果、活性型の組換えETS-1を71±15%の収率で得ることに成功しています。

イオン交換/疎水性相互作用クロマトグラフィー担体を用いる方法

イオン交換あるいは疎水性相互作用クロマトグラフィー担体にインクルージョンボディを不溶性のまま吸着させ、塩で溶出させることにより、可溶性とリフォールディングを同時に行ってしまう例が報告されています。Hoessら(6)は3種類の組換えタンパク質のインクルージョンボディを不溶性のまま、Q Sepharose FastFlow(アマシャムファルマシアバイオテクK.K.)に吸着させ、NaClを加えて溶出させることにより活性型のタンパク質を回収しています。
また同時に彼らはS Sepharose FastFlowやPhenyl Sepharose(アマシャムファルマシアバイオテクK.K.)を用いたリフォールディングについても言及していますが、この場合には吸着は必要ないと述べています。

(1). Weir，M.P and Sparks，J.，Biochem. J., 245，85-91(1987).
(2). Gill, J. A. et al., Bio/Technology, 3, 643-646(1985).
(3). Marciani, D. J., et al., In:Protein purification:Micro to Macro, Alan R. Liss，inc.,443-458(1987).
(4). Fountoulakis, M. H. et al., J.Biol.Chem., 265,13268-13275(1990)
(5). Werner, M. H. et al., FEBS Letters, 345, 125-130(1994)
(6). Hoess, A., et.al., Bio/Technology, 6,1214-217(1988)

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